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Cas9系统一步克隆大基因簇技术,微生物次生代谢
分类:科技创新

大片段基因簇(尤其是高附加值生物分子的基因簇)的克隆是微生物功能基因组研究中最为基础和关键的步骤。传统基于PCR的克隆方法或者通过构建基因组文库筛选等方法存在着克隆片段长度的限制、易产生突变、步骤复杂、效率低下等缺点。因此开发一种快速简单的方法来获得大尺度的基因簇片段至关重要。

生命学院朱听课题组在《自然-通讯》发文

核心提示:近日,记者从中科院南海海洋研究所获悉,该所海洋微生物代谢工程与组合生物合成课题组研究员张长生领导的团队在次生代谢产物的生物合成研究方面取得重大进展。生技网资讯: 近日,记者从中科院南海海洋研究所获悉,该所海洋微生物代谢工程与组合生物合成课题组研究员张长生领导的团队在次生代谢产物的生物合成研究方面取得重大进展。该团队完成了重要抗菌剂台勾霉素的生物合成基因簇的克隆、鉴定和关键酶的功能阐述。这项研究的部分成果已于近日在线发表在《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society)上。 据专家介绍,台勾霉素(tiacumicins)由放线菌指孢囊菌NRRL 18085产生,具有抗各种革兰氏阳性菌的活性,针对艰难梭菌引起腹泻的疗效优于万古霉素,目前已经在美国进入三期临床试验。 张长生课题组从指孢囊菌NRRL 18085中克隆和鉴定了长约111 kb的DNA片段,包含了50个开放阅读框,涵盖了完整的台勾霉素生物合成基因簇。通过构建指孢囊菌的遗传操作体系并进行基因敲除突变,确定了台勾霉素生物合成基因簇的边界,证实了其中31个ORF与台勾霉素的生物合成相关,同时从7个关键基因的突变株中分离鉴定了18个台勾霉素新结构类似物,从而清晰阐明了2个糖基转移酶(TiaG1和TiaG2),2个细胞色素P450氧化酶(TiaP1和TiaP2),1个酰基转移酶,1个C-甲基转移酶和1个卤化酶的体内功能。另外,体外生化实验表明,卤化酶TiaM能够以脱氯的台勾霉素作为底物进行两次有序的卤化反应,从而首次在原核生物中发现并证实了具有后修饰功能的卤化酶。这项研究揭示了台勾霉素的生物合成途径和生物合成机理,充分展示了组合生物合成技术在丰富天然产物结构多样性方面的潜力。 这项研究获得国家自然科学基金、中国科学院“百人计划”和知识创新工程以及“973”计划等的支持。关键字:次生代谢 生物合成 微生物

近日,中国科学院微生物研究所娄春波课题组与清华大学、特拉维夫大学合作开发了利用CRISPR-Cas9系统一步靶向克隆上百kb的基因簇片段的方法。该方法利用RNA-介导的CRISPR-Cas9核酸内切酶精确地切割所需克隆的任意基因簇片段两侧,并且通过Gibson组装方法将切割下来的大片段与目标载体进行连接,达到一步克隆的目的。利用该方法我们成功克隆了不同尺度(50-150 kb)的大肠杆菌基因组片段,并在其他细菌(枯草芽孢杆菌,链霉菌)中成功克隆了芽孢、金霉素、杰多霉素等生物合成基因簇。

报道靶向克隆合成生物学新技术CATCH

清华新闻网9月8日电 9月1日,清华大学生命科学学院朱听研究员课题组在《自然-通讯》上在线发表了题为《CATCH技术实现大型基因簇一步法靶向克隆》的论文,首次体外应用Cas9系统实现对上百kb的基因组片段的靶向克隆。该技术的开发将极大简化对能够表达具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步骤,节省时间并降低成本,该技术有望广泛应用于合成生物学、基因测序、精准医疗等领域。

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CATCH技术示意图。

分子克隆技术已被广泛应用于现代生物学的各个领域,但传统的PCR技术通常很难一步得到15 kb以上的片段,传统的限制性核酸内切酶识别位点仅6-8个碱基,对生物基因组不能有效实现特异性,因此对于较长目标片段的克隆或合成始终存在阳性率低,步骤复杂,成本高等问题。近年来人们在细菌中发现的CRISPR系统可以实现对外源序列的特异性识别和有效切割,在此基础上,科学家们开发出许多基因编辑、基因表达调控,体内成像等工具。然而对该系统的体外应用则鲜有报道。朱听课题组利用体外转录制备的sgRNA和表达纯化的Cas9蛋白特异性酶切目标全基因组,并通过同源序列互补将长达100 kb的目标片段一步连接到细菌人工染色体上实现特异性克隆。通过脉冲场电泳可以清晰观察到目标大片段从全基因上的有效分离,其克隆效率可与普通短片段克隆相当。

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应用CATCH技术有效分离大片段的脉冲场电泳胶图。

朱听课题组致力于合成生物学及基因组学研究,本文第一作者为清华大学生命科学学院2012级博士研究生姜文君,通讯作者为清华大学生命科学学院研究员朱听、以色列特拉维夫大学研究员Yuvul Ebenstein及中科院微生物所研究员娄春波。本课题得到科技部、国家自然科学基金委、清华-北大生命科学联合中心、感染性疾病诊治协同创新中心的经费支持。

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供稿:生命学院 编辑:蕾蕾

该技术已于9月1日在Nature Communications杂志在线发表,文章第一作者是清华大学博士生姜文君,微生物所赵学金做出了前期领先的重要贡献,并已经与合作单位联合申请了国际专利及国内专利。

文章链接

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图1. CATCH技术示意图

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图2. 应用CATCH技术克隆芽孢,杰多霉素生物合成基因簇鉴定结果

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